Mark Twain est issu d’une famille installée de longue date sur le continent américain, dont la trajectoire a épousé le front pionnier dessiné par les colons. L’environnement de l’enfance de Twain est donc le monde de « la Frontière » américaine. Toutefois, la famille Clemens, tout comme Twain lui-même une fois parvenu à l’âge adulte, ne compte pas aux rangs des aventuriers et des défricheurs partis à l’avant-garde du mouvement de colonisation vers l’Ouest. Elle s’est glissée dans le sillage de ce vaste mouvement de population et s’est installée sur des terres déjà travaillées par les colons où la vie sociale est déjà relativement stabilisée.
Sa mère, Jane Lampton, est née dans le Kentucky au sein d’une famille qui fait vraisemblablement partie des premières générations de pionniers à franchir la chaîne des Appalaches ; la légende familiale lui prête une lointaine ascendance avec les Lampton, ducs de Durham.
La branche paternelle de la famille est originaire du Sud du pays. Son grand-père, fermier en Virginie, migre vers le Kentucky au début du xixe siècle pour y devenir percepteur (commissioner of revenue). Le père de Twain, John Marshall Clemens, fait des études de droit dans l’Est puis revient dans le Comté d’Adair (Kentucky) où il épouse Jane Lampton en 1823. Il exerce la fonction d’« attorney » et court sa vie durant après la fortune. Sa quête le mène successivement dans le Tennessee, à Gainesboro puis à Jamestown dans le Fentress County, où il investit ses économies dans 75.000 acres de terres. Le faible nombre d’affaires de justice à traiter le pousse à la reconversion : il se fait marchand, en ouvrant un magasin d’approvisionnement général, typique de la frontière. Il tente sa chance dans plusieurs localités du Tennessee puis rejoint John Adams Quarles, le beau-frère de sa femme, dans le Missouri sur les conseils de ce dernier. Le village de Florida (comté de Monroe) dans lequel la famille s’installe est le théâtre de la naissance de Samuel Langhorn Clemens, le cinquième enfant de la famille.
Mark Twain a prétendu ultérieurement avoir eu un frère jumeau (d’où viendrait son pseudonyme), et il a répété à plusieurs reprises une histoire inventée de toutes pièces où son frère se serait noyé dans une baignoire : « Vous comprenez, nous étions jumeaux — le défunt — et moi — et on nous a mélangés dans la baignoire quand nous n’avions que deux semaines, et l’un de nous s’est noyé. Mais nous ne savions pas lequel. Certains pensent que c’était Bill. D’autres pensent que c’était moi. ».
En mars 1847, son père meurt d’une pneumonie. Sa disparition bouleverse la vie de la famille Clemens. Au mois de mai de l’année suivante, le futur Mark Twain, âgé de douze ans, quitte l’école et devient apprenti typographe dans l’imprimerie locale. À défaut d’être agréable, le métier qu’il expérimente est à cette époque susceptible d’offrir des revenus réguliers. Chaque village de quelque importance possède en effet au moins un journal. À partir de 1850, le jeune homme travaille pour le Western Union, un hebdomadaire dont son frère aîné, Orion, est le fondateur. Il y rédige ses premiers papiers et s’imprègne des techniques et des thèmes journalistiques de son temps, à une période où l’abondance de la production et un système d’échange gratuit facilitent la circulation de l’information au sein de la profession.